Гистология — Центр Гистологии в Киеве

Для уточнения механизмов регенерации печени под влиянием ксенотрансплантации ККП было проведено количественное исследование содержания ДНК в ядрах ГЦ крыс основной и контрольной 1 групп на 2,4 сутки эксперимента. Результаты цитофотометрического исследования представлены в табл. 5.4.

Как видно из таблицы, ОТП привело к появлению ядер с разнообразным количеством ДНК. Относительное количество ядер с диплоидным набором ДНК у животных основной группы существенно (р=0,04) снижалось по сравнению с нормой, а в контрольной группе, напротив, несколько увеличивалось и значимо отличалось от показателя основной группы (р=0,002). К 4 суткам эксперимента количество ядер с диплоидным набором было минимальным у крыс основной группы (р=0,0001), а в контроле преобладало (р=0,002).

Таблица 5.4

Распределение ядер гепатоцитов по содержанию ДНК (%)

Примечания: значимость различий определена по критерию Манна-Уитни; * -различия незначимы (р>0,5); р1 – значимость различий показателей по сравнению с нормой; р2 – значимость различий показателей по сравнению с предыдущим в группе; р3 – значимость различий показателей в основной и контрольной группах.

В обеих исследованных группах было отмечено снижение количества тетраплоидных ядер на 2 сутки эксперимента (p<0,01), межгрупповые различия были незначимыми. К 4 суткам в основной группе отмечено существенное повышение удельного веса тетраплоидных ядер по сравнению с нормой (р=0,004), а в группе контроля этот показатель продолжал снижаться и был существенно ниже нормы (р=0,0001) и предыдущего значения (р=0,002).

Октаплоидные ядра встречались в одноядерных ГЦ основной группы на 2 сутки существенно чаще, чем в норме  и в контроле (р=0,0001), между тем их количество в контрольной группе также было достоверно выше нормальных значений (р=0,001). К 4 суткам исследования удельный вес октаплоидных ядер продолжал нарастать в основной группе (р=0,0001 по сравнению со 2-ми сутками), а в контроле снижался до нормы и был существенно ниже, чем в основной группе (р=0,006).

Таким образом, при анализе содержания ДНК в ГЦ экспериментальных животных установлены 2 разнонаправленных процесса; при этом в основной группе происходит существенное нарастание октаплоидных ядер с одновременным снижением количества диплоидных и нормализацией уровня тетраплоидных ядер. В контроле отмечено закономерное повышение количества диплоидных ядер с уменьшением процентного соотношения тетра- и октаплоидных.

Электронная микроскопия образцов печени крыс основной и контрольных групп на 2 сутки исследования демонстрировала однотипную картину. Данные  морфометрического исследования ультраструктуры ГЦ представлены в табл. 5.3. Как следует из таблицы, среднее значение площади ядра достоверно увеличивается по сравнению с нормой (30,0±0,4) и составляет соответственно 35,0±2,4 у.е., 34,0±2,2 у.е.,35,4±1,7 у.е. (р<0,05). При сравнении площади ядра существенных межгрупповых различий не выявлено.  Средняя площадь цитоплазмы в клетках животных основной и контрольных групп достоверно увеличивается по сравнению с нормой (6,8±0,1 у.е.) и составляет соответственно 8,3±0,2 у.е., 8,4±0,3 у.е., 8,7±0,2 у.е. (р<0,05).  При  электронно-микроскопическом исследовании печени у животных всех групп в большинстве ГЦ отмечалось понижение электронной плотности цитоплазматического матрикса; выявляются существенные сдвиги важнейших внутриклеточных структур. Профили каналов гранулярного ЭР не имеют большой протяженности, расширены и фрагментированы, на большом протяжении лишены рибосом. Объемная доля гранулярного  ЭР достоверно увеличивается в основной и контрольных группах (9,1±0,8%;  10,1±1,2%; 10,8±1,0% соответственно) по  сравнению с нормой (6,5±0,2%; p<0,05), при этом статистически значимых различий между группами не выявлено.  Численная плотность гранулярного ЭР возрастала во всех группах за счет увеличения его фрагментации.

Таблица 5.3.

Результаты (M±m) морфометрического исследования
ультраструктуры гепатоцитов

Примечание: Значимость различий определена по критерию    Стьюдента; * – различия незначимы (р>0,5); р1 – значимость различий показателей по сравнению с нормой ; р2 – значимость различий показателей по сравнению с предыдущим в группе ; р3 – значимость различий показателей в основной и контрольной 1 группах ; р4 – значимость различий  показателей в основной и контрольной 2 группах.

Митохондрии большей частью округлой формы, их матрикс гомогенный, электронно-светлый, кристы различной длины,    просматриваются плохо. Встречаются вакуолизированные    митохондрии с полностью разрушенными кристами. При морфометрическом исследовании отмечали увеличение объемной доли митохондрий в основной группе до 29,7±0,7% (при норме 20,0±1,4%,р=0,006). В группах контроля объемная доля митохондрий не имела значимых различий с нормальным показателем. Снижение численной плотности митохондрий отмечали во всех группах. К отдельным митохондриям прилежат первичные лизосомы.  Лизосомы как первичные, так и вторичные встречаются по всей площади цитоплазмы. Особенно много вторичных лизосом около желчных канальцев. Довольно часто встречаются миелиновые тельца.

Липидные включения  располагаются в виде капель различной величины. Гранулы   гликогена встречаются редко в единичных количествах и   располагаются между мембранами гранулярной сети и    митохондриями.  Ядра имеют светлый матрикс. Околоядерное пространство ядерной оболочки у большинства ядер на большом протяжении расширено. Хроматин располагается отдельно лежащими глыбками по всему срезу ядра. Изменения в комплексе Гольджи сводятся к дезорганизации его компонентов, которые представлены в виде вакуолей. Желчные канальцы значительно расширены. Между отдельными ГЦ выявляются очень широкие межклеточные щели.  Ультраструктура стенки синусоидов нарушена. В пределах одного среза встречаются синусоиды как с    равномерно расширенным, так и деформированным просветом. В них располагается большое количество эритроцитов.

Клетки Купфера в большинстве случаев набухшие.  Их ядра увеличены в объеме, ядрышко располагается эксцентрично. Ядерный хроматин разбросан по всей площади ядра. Отмечаются признаки активации фагоцитарного аппарата.    В цитоплазме наблюдаются скопления лизосом, остаточных телец и липидных капель. Каналы гранулярного ЭР значительно расширены, резко увеличено количество вторичных лизосом. Зачастую отростки клеток Купфера проникают в пространство Диссе. Последнее на больших промежутках значительно расширено и заполнено аморфным электронно-светлым материалом.

Исследование ультраструктуры печени в основной и контрольных группах  на 4 сутки эксперимента выявило значительные различия. При электронно-микроскопическом исследовании в ткани печени животных основной группы преобладают ГЦ со светлой гиалоплазмой,  их цитоплазма окрашивается толуидиновым синим равномерно. Гранулярный ЭР представлен  расширенными   цистернами, имеет большую протяженность и сохранившийся рибосомальный аппарат. Обращает на себя внимание значительное снижение в цитоплазме как первичных, так и вторичных  лизосом.  Жировые включения при сравнении с контролем    встречаются в значительно меньшем количестве и их диаметр   существенно меньше (рис. 5.3).

Кариометрическое исследование показало, что средняя площадь ядер у крыс основной группы на 4 сутки составляет 46,5±1,1 и достоверно выше нормы (30,0±0,4; р=0,001). Средняя площадь цитоплазмы уменьшается в основной группе до 7,1±0,49 по сравнению с предыдущими сутками (8,3±0,2,р=0,006), но превосходит нормальные значения (6,8±0,1; р=0,04).

Рис.5.3. Участок цитоплазмы гепатоцита крыс основной (A) и контрольной 1 (Б) групп на 4-е сутки эксперимента. Электронограмма.Ув. 45000.  1 – гранулярный ЭР с сохранившимися рибосомами; 2 – вакуолизированный гранулярный ЭР, лишенный рибосом.

В контроле средняя площадь цитоплазмы увеличивается до 10,2±0,9 у.е. и 10,9±0,3 у.е.; р=0,001). В просвете синусоидов встречаются как отдельно лежащие   клеточные органеллы, так и целые участки цитоплазмы. ГЦ заполнены темным цитоплазматическим матриксом. Деструктивные изменения представлены расширением и фрагментацией гранулярного ЭР. Цитоплазма заполнена жировыми включениями различного диаметра. Во многих ГЦ эти включения занимают практически весь объем гиалоплазмы. Гликоген, так же как и первичные лизосомы практически исчезают из цитоплазмы. Большинство митохондрий набухшие, с гомогенноплотным матриксом, кристы просматриваются плохо или полностью разрушены.

Визуальную картину подтверждают и количественные данные. Морфометрическое исследование показало существенное увеличение объемной плотности гранулярного ЭР по сравнению с нормой (6,5±0,2) во всех группах: в основной – 14,0±1,8 (р=0,001), в контрольной 1 – 31,5±2,4 (р=0,0001); в контрольной 2 – 36,8±2,3 (р=0,0001).  Численная плотность фрагментов в основной группе не имеет достоверных отличий от нормы. В группах контроля    отмечается увеличение числа фрагментов гранулярного ЭР до 79,4±2,7 и 79,9±3,1 при норме 40,1±2,5 (р=0,001).

Стопки и цистерны комплекса Гольджи  значительно расширены,  в отдельных ГЦ отмечается их деструкция.  Перинуклеарное пространство на значительном протяжении расширена. Встречаются глубокие инвагинации ядерной оболочки. Средняя площадь ядер в контроле составила 37,6±1,8 у.е. и 38,1±1,3 у.е., что существенно ниже, чем в основной группе (46,5±1,1; р=0,001).

В контрольном материале наблюдается перестройка стенки синусоидов, часто встречаются набухшие синусоидальные клетки. Местами их плазмолемма разрыхлена и разрушена, тогда в просвете синусоидов встречаются клеточные органеллы и мембраны. Клетки Купфера значительно увеличены в объеме, часто занимают весь просвет синусоида. Их ядра крупные, кариолемма изрезана. Ядрышки просматриваются плохо. В цитоплазме в большом количестве встречаются вторичные лизосомы, вакуоли, липидные включения различных размеров. Каналы гранулярного ЭР значительно расширены, часто на большом протяжении лишены рибосом. Микроворсинки ГЦ, выступающие в пространство Диссе, сглажены.

Таким образом, анализ ультраструктуры ГЦ позволил предположить активацию регенераторных клеточных процессов под влиянием трансплантации эмбриональной ККП в условиях ОТП. Для оценки  митотической активности  клеток было предпринято  сравнительное исследование содержания  ДНК в ядрах ГЦ.

При морфологическом исследовании печени животных основной и контрольных групп на 2-е сутки эксперимента с применением световой микроскопии структурных различий не выявлено. Очаги некрозов центролобулярной локализации, участки дискомплексации балочных структур, вакуолизация гепатоцитов и их липидная инфильтрация характеризовали однотипную картину токсического повреждения печени. Наиболее выраженные изменения, характерные для ОТП, были обнаружены на светооптическом уровне в центральных областях печени.

Патоморфологическая картина в печени животных  на 4 сутки  становилась различной в основной и контрольных группах (рис. 5.2). В печени животных основной группы отмечали умеренные гемодинамические нарушения в виде гидропической и балонной дистрофии единичных ГЦ и мононуклеарной инфильтрации таких участков. Отмечается восстановление архитектоники    балок и сохранность дольчатого строения печени. Среднее значение неповрежденных паренхиматозных клеток на один некротизированный ГЦ у животных основной группы составило 7,5±0,9 и было достоверно выше (p<0,05) по сравнению с контрольными значениями (контрольная группа 1 – 3,5±0,4; контрольная группа 2 – 3,7±0,9). Размеры очагов некроза, локализованных в центре долек, сокращались, при этом сохранялась незначительная мелкокапельная жировая дистрофия печени. У животных контрольных групп наблюдалась картина выраженных деструктивных изменений. Синусоидальные капилляры расширены, в них отмечается скопление эритроцитов. Около некротически измененных ГЦ наблюдаются скопления нейтрофилов и лимфоцитов. Ядра ретикулоэндотелиальных клеток значительно увеличены в объеме и часто выступают в просвет капилляров. В ГЦ преобладали признаки прогрессирующей жировой и гидропической дистрофии, приобретающие к 5 суткам исследования тотальный характер.

Рис. 5.2. Структура печени при ОТП. 4-е сутки эксперимента, световая микроскопия. А – основная группа, Б -  контрольная группа 1, В – контрольная группа 2. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.10х10. 1 – балки ГЦ; 2 – вакуолизированные ГЦ; 3 – очаги соответствующие локализации липидов при окраске суданом III.

Для проведения морфометрического исследования весь спектр клеток печени крысы был условно разделен нами на три группы. Выделяли ГЦ без признаков повреждения и ГЦ с разной степенью вакуолизации цитоплазмы (с крупными вакуолями) и непаренхиматозные фагоцитирующие клетки (макрофаги, нейтрофильные лейкоциты, эндотелиальные клетки) – табл.5.2.

Как следует из табл. 5.2., соотношение клеточных элементов  в печени  животных основной и 1 контрольной групп оказалось различным. Так, в основной группе к 4 суткам эксперимента  удельный вес неповрежденных ГЦ был существенно (p< 0,001) выше, а  вакуолизированных – ниже (р=0,002), чем в контроле. В дальнейшем  отмечено достоверное повышение (р=0,002) количества  неповрежденных ГЦ в печени крыс основной группы  с  одновременным уменьшением  (р=0,0001) числа вакуолизированных клеток.

Таблица 5.2.

Результаты количественной морфометрии  печени  животных
по данным световой микроскопии

Примечание: * – морфология на 5 сутки исследована у животных 2 группы; ** – незначимые различия по критерию Манна-Уитни (p>0,1); р1 – значимость различий показателя в группе 1 по сравнению с показателем в группе 2 (5 и 6 сутки исследования); р2 – значимость различий показателя по сравнению с предыдущим в группе.

В группе контроля, напротив, к 5 суткам  количество  ГЦ с сохраненной структурой  несколько снижалось, а поврежденных – существенно (р=0,0001) возрастало. Лишь в отношении  пула фагоцитирующих клеток  был определен однонаправленный сдвиг -  количество этих элементов не имело межгрупповых различий и существенно (p<0,003)  возрастало к следующему сроку исследования по сравнению с предыдущим.

Таким образом, в исследовании на светооптическом уровне нами установлены существенные различия строения печени животных опытной и контрольной групп в динамике эксперимента. Для уточнения саногенных механизмов воздействия трансплантации эмбриональной ККП было предпринято исследование на ультраструктурном уровне.

Поскольку, по данным литературы, увеличение массы печени закономерно сопровождает ОТП вследствие отека и цитолитического процесса, нам показалось важным исследовать этот показатель в динамике эксперимента.

Масса печени животных на 2 сутки эксперимента существенно возрастала во всех группах по сравнению с нормой (р<0,05), однако  при сравнении показателя между  группами достоверных различий выявлено не было  (табл. 5.1).

На 4 сутки эксперимента  масса печени достоверно повышалась в обеих контрольных группах по сравнению с предыдущим значением (p=0,002), нормой (p=0,002) , а различия по этому показателю с основной группой также оказались значимыми (p=0,007). В то же время при сравнении массы печени крыс основной группы на 2,4,6 сутки значимых различий не установлено. Следует отметить, что масса печени у животных основной группы на 6 сутки была повышена по сравнению с нормой (p=0,02).

Таблица 5.1

Масса печени в динамике эксперимента

Примечания: значимость различий определена по критерию U (Манна-Уитни); * – значимость различий отсутствует; Р1- значимость различий показателя по сравнению с нормой; Р2- значимость различий по сравнению с предыдущим показателем в группе; Р3- значимость различий в группах 1 и 2 (те же сутки); Р4- значимость различий в группах 1 и 3 (те же сутки); Р5- значимость различий в группах 2 и 3 (те же сутки).

Макроскопические изменения в печени были различными в основной и контрольных группах. Так в основной группе печень плотной консистенции и по цвету близка к печени интактных крыс. В группах контроля печень была увеличена в размерах,  имела рыхлую консистенцию и светлый желто-коричневый цвет со своеобразным рисунком мускатности.  Рассмотрим теперь строение  печени животных  при ОТП в зависимости от характера лечебного воздействия.

Для определения судьбы пересаженных клеток была выполнена световая микроскопия зоны ксенотрансплантации. Макроскопически зона трансплантации в подкожной основе представляла собой узелок ткани красно-коричневого цвета, напоминающий по размерам и форме рисовое зерно, в пленочной капсуле с мелкими капиллярами. Описанное образование обнаруживали у каждого животного основной группы, выведенного из эксперимента на 6 сутки. Микроскопически  капсула имела вид гомогенной гиалинизированной пленки с единичными малодифференцированными фибробластами. По периферии этой пленки в соединительной ткани дермы определялась высокая концентрация малодифференцированных фибробластов (рис. 5.1).  Обнаруживали комплексы клеток, по форме и структуре соответствующие гепатоцитам, расположенные по периферии трансплантата, без перифокальной лейкоцитарной инфильтрации.  Ядра клеток без явлений кариолиза, с четкими границами. Центральная зона трансплантата была представлена зоной некроза с единичными клетками ближе к периферии.  Таким образом, ксеногенные эмбриональные гепатоциты, пересаженные под кожу животного с индуцированной ОПН, частично выживают к 6 суткам после введения.  Структура трансплантата соответствует классическим описаниям перенесенной ткани при свободной алло- и аутотрансплантации, что говорит о низкой иммуногенности приготовленной культуры клеток эмбриональной печени.

Рис.5.1. Структура трансплантата у крыс основной группы через 6 суток после введения культуры клеток печени. 1 – клетки    соединительной ткани, 2 – слой сохранившихся гепатоцитов,  3 – центральная зона некроза. Окраска гематоксилином и эозином. А – ув.10х10; Б – ув. 10х40.